Peter Parker (Tobey Maguire) to 18-letnia sierota mieszkająca u wujostwa Bena i May Parkerów (Cliff Robertson i Rosemary Harris). Jest geniuszem fizycznym. Od wielu lat kocha się także w swojej sąsiadce Mary Jane Watson (Kirsten Dunst). Jednak chłopak ten wśród rówieśników jest poniżany i traktowany jak rzecz. Na początku filmu poznajemy także jego przyjaciela - Harry'ego Osborna (James Franco) i jego ojca Normana Osborna (Willem Defoe), który jest szefem wielkiej firmy produkującą nowoczesną broń - Oscorp Industries.
Podczas wycieczki do Wydziału Fizyki na Uniwersytecie Columbia uczniowie zapoznają się ze zmodyfikowanymi genetycznie "superpająkami". Jeden z nich ucieka i gryzie Petera w rękę, a ten po powrocie do domu mdleje. Mniej więcej w tym samym czasie w Oscorp Norman Osborn decyduje się na przebadanie na sobie środka wzmacniającego siłę ludzką. Po tym, jak opary dostały się do jego krwi, mężczyźnie przestaje bić serce. Ratuje go dr. Stromm i gdy wygląda na to, że nie ma już nadziei, Osborn budzi się. Z wściekłością zabija doktora i kradnie skafander oraz ślizgacz - nowoczesną broń.
Gdy Peter budzi się rano zauważa, że coś jest nie tak. Widzi dobrze bez okularów, a jego sylwetka stała się bardzo umięśniona. Chłopak biegnie do szkoły gdzie zdarza się incydent - niechcący zaczepia najsilniejszego chłopaka w klasie "Szybkiego Thompsona". Nawiązuje się bójka, w której chłopak bez trudu pokonuje osiłka. Odkrywa także swoje nadludzkie moce - strzelanie z sieci, wielka siła, wielka skoczność z akrobacjami oraz pajęczy zmysł, który pozwala mu na przewidywanie przyszłości. Wybiega ze szkoły i w ciemnym zaułku pozwiązuje nagłą zmianę kondycji z wczorajszym ugryzieniem przez pająka. Okazuje się także, że Peter umie chodzić po ścianach.
Rano śpiącego na podłodze w swoim gabinecie Norman'a Osborna znajduje jego syn - Harry. Norman nic nie pamięta. Dowiaduje się o śmierci dr. Stromma.
Peter wieczorem podsłuchuje rozmowę M.J z jej ojcem i rozmawia z nią. Postanawia kupić sobie samochód, by jej zaimponować. Podczas oglądania ofert sprzedaży używanych aut dostrzega ogłoszenie o zawodach Wrestlerskich. Postanawia wziąć w niej udział. Projektuje kostium Spider-Mana. Wujkowi Benowi mówi, że musi pojechać do biblioteki, a naprawdę wybiera się na zawody. Ten go odwozi pod bibliotekę gdzie wraz z Peterem, któremu się śpieszy, zaczynają się kłócić. Wujek Ben wypowiada wtedy słowa "Wielka siła to wielka odpowiedzialność"